组织工程补片及3D打印技术在盆腔重建手术中的应用前景

      摘要：手术是重度盆腔器官脱垂主要的治疗方式。目前补片是盆底手术的焦点，聚丙烯补片虽能明显减低复发率，但有侵蚀、暴露、感染等副反应，生物源性补片虽有很好的组织相容性，但支持能力不强。目前，应用组织工程学及3D打印技术开发研制新型补片是研究热点。文章综述了目前国内外组织工程补片的研究现状及应用前景。

1 盆底补片应用现状

      女性盆底功能障碍性疾病（pelvicfloordys⁃ function，PFD）是中老年妇女的常见病、多发病，发病率高达30%~50%，尤其在经济欠发达地区更为常见。其病因主要为盆底结缔组织、肌肉和神经 在生物力学、生殖内分泌改变和结缔组织代谢的共同作用下，使盆底支持功能进行性受损所致。 主要表现为盆腔器官脱垂（pelvicorganprolapse，POP）、压力性尿失禁和排便障碍等，可严重影响患者的日常生活，因此也被称为 “社交癌”。手术是重度PFD主要的治疗方式。盆底器官脱垂的病理基础是盆底支持结构的损伤和薄弱，这些支持结构包括有盆底的肌肉、筋膜和韧带。不同支持部位的缺损可引起不同的临床表现，如耻骨宫颈韧带损伤薄弱可引起压力性尿失禁，耻骨宫颈筋膜缺损可引起阴道前壁脱垂及膀胱膨出，直肠阴道筋膜缺损可引起阴道后壁脱垂，子宫骶骨韧带薄弱可表现为子宫脱垂等。完美的手术方式应是针对特异性的缺损部位进行修复，并尽可能恢复器官功能。目前临床上常用的手术方式有自体组织修复性手术和补片植入性手术。由于自体组织本身已薄弱，因此利用自体组织进行修复的手术术后复发率较高，国内外资料显示5年内复发率可达 30%。因此，近年来补片成为盆底功能障碍手术的焦点，根据补片材料的来源和性质，盆底重建的替代材料分为化学合成补片与生物源性补片：化学合成补片如聚丙烯补片为最早应用于盆底修复的补片，其力学性能好，复发率低。但随着聚丙烯补片的广泛应用，因其生物相容性差所引起的并发症渐渐为人们所认识，如补片侵蚀、暴露、感染等。生物源性补片因其良好的生物相容性而应用于临床。所谓生物补片，是指材于动物或人的组织，经脱细胞处理去除组织细胞但保留细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的框架结构。移植到人体内后经过一段时间可以完全被吸收。根据来源的物种、部位、消毒及交联制作等的不同，生物补片分为多种，常用的有来源于人尸体或猪的脱细胞真皮、牛心包、牛腹膜、猪小肠等补片。 每种补片有其各自的特点。与合成补片相比，生物补片的侵蚀、感染及瘘形成率明显降低。但多项研究表明，生物补片移植入体内后逐渐降解，且降解速度可能快于新生组织的形成速度，从而造成支持能力下降、PFD复发。 因此，目前的研究热点是研发出结合现有的化学合成补片和生物补片的优点，既能适应盆底的力学环境、为脏器提供足够支撑，又兼具良好的生物相容性，没有侵蚀暴露等并发症的补片。

2 组织功能学补片的研究现状

      再生医学（regenerativemedicine）指利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官或组织的技术。可体外培养自体细胞后局部注射，或同时培养不同的细胞，加入生物活性因子，种植到支架上，此种方法即组织工程（tissue engineering）。自20世纪80年代组织工程学的概念提出后，组织工程技术不断应用于缺失或损伤 组织的修复，现已进行了广泛基础研究并涉及临 床医学的各个领域。一般来说，有效的组织工程修复，需经过体内、体外两个阶段的研究过程。主要包括：（1）构建具有良好生物相容性的生物学支架，为移植细胞提供定向生长和器官修复的微环境。（2）将细胞在体外扩增并使其在新生组织中定 向分化与生长。由此可见，组织工程的核心是建 立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，组 织工程的三要素包括：种子细胞（cell）、支架（scaf⁃ fold）及讯息因子（signal）。 目前在运动损伤的再生修复研究中，膝关节 前交叉韧带的重建已获得良好的临床效果。在泌尿系统疾病的研究中，组织工程膀胱和尿道缺损的修复已经初步取得成功。Mitterberger等首次采用自体成肌及成纤维细胞经尿道超声引导下 注射治疗妇女压力性尿失禁（SUI）20例，结果发现2年后16例患者完全治愈，尿失禁及生活质量评分明显改善，尿道厚度、横纹括约肌厚度、横纹括约 肌收缩性显著增加。再生医学在女性盆底功能障碍性疾病领域也有极好的发展和应用前景。De Filippo等应用兔阴道的活检组织来源的细胞建立自体细胞来源的阴道组织并发现具有良好的电 刺激应答反应。但单纯细胞注射的应用有一定的限制,基质成分的缺失可造成细胞的死亡，支架不仅可为盆底提供有力的支撑，而且可作为基质成分为种子细胞或周围组织提供黏附支持。且女性盆底结构较为特殊，阴道壁结构复杂且局部组织的弹性强度因人而异，故而应用自体来源的组织细胞建立个体化的组织工程补片可能为这些问题提供答案。 尽管已有一些动物实验证实组织工程在妇科 泌尿学应用的可行性，但目前国内外临床研究和经典组织工程修复材料的构建研究相对不足，且应用组织工程进行盆底功能障碍的治疗，国外基础实验研究尚少，无临床试验研究。 北京大学人民医院妇科近年来致力于盆底组织工程补片的研发。在前期工作中，课题组经过反复摸索已成功培养出脂肪间充质干细胞（AD⁃ SCs），在体外将其定向诱导分化为成纤维细胞后， 种植到特质的丝素蛋白支架上，成功构建成组织 工程补片。镜下检测到细胞呈三维排列，在支架上稳定增殖分泌细胞基质。经动物模型体内实验表明，自体来源的ADSCs与丝素蛋白支架构成的 组织工程补片在体生物相容性好，组织工程补片血管生成密度高。另外，组织工程补片的组织形成情况与降解速率相匹配，力学性能优于传统的 生物源性补片。目前实验仍在进行中。

3 3D打印技术在组织工程补片构建中的应用

      研究发现，传统组织工程方法，即体外将种子细胞种植到支架上培养后再植入体内，有一定的局限性：如仅可构成简单的无血管、无淋巴管、无 神经的薄层组织或中空器官，构建周期长，不能构建厚度>150μm的组织或器官，且多数仅限于应用单一细胞进行组织工程的构建，细胞在支架上定位及分布亦难以控制等。为解决这些问题，1999 年学者们首次提出生物打印技术，通过逐层“打印”细胞和细胞外基质，使之逐层堆积，直至形成三维器官。较之传统的组织工程学方法，生物打印建模迅速，可同时打印多种细胞、细胞因子、细胞外基质及支架材料，使其在三维空间内精确分布；亦可同时完成器官组织中的细胞外基质、血管 重建；进而建立有一定体积的器官组织，亦可被称 为 “器官打印”。 生物打印在组织功能缺陷或器官功能衰竭等医学领域有良好的应用前景，可以用来替代和修复目标组织或器官，不仅解决了目前器官移植供体稀缺的问题，而且采用自体来源的细胞可以很好地解决同种异体组织器官移植所造成的免疫排 斥，避免了免疫排斥药物的应用，减少费用，减轻患者的负担，提高患者的生存质量。此外，还可用于建立药物筛选平台，检测药物的安全性和有效性，以及组织或肿瘤模型而用于实验室研究。因此，一些发达国家已将3D打印技术作为发展重点。目前生物打印已经应用于构建结构比较简单、细胞种类较少的组织器官。Sachs等应用3D 打印技术将20层成纤维细胞和20层角质细胞置于异体真皮组织上构建人工皮肤，植入后角质细 胞角化形成复层上皮结构并与周围组织良好整 合。Vacanti应用3D打印技术以牛耳软骨细胞体外构建人工耳廓治疗小耳症，成功构建与健侧耳形态及组织结构高度相似的、生物相容性良好的人工耳。目前，随着技术的发展，3D打印也逐渐应用于如肝脏等有复杂组织架构和功能的器官构建。 国内外尚无将3D生物打印技术应用到女性盆底修复的报道。目前的盆底组织工程补片制作工艺复杂并存在一些难点，如生物支架的密度、孔 径、厚度、编织方式要求精细并需具有良好的力学性能；细胞的体外培养耗时长、培养条件苛刻、花 费高；补片构建耗时长，对细胞的分布及细胞数目难以精准调控等。3D打印技术似乎可以帮助解决上述问题。但3D打印技术本身还有待成熟和发展。最早的细胞打印机借鉴了喷墨打印机的原理，实践发现喷墨式打印机由于在短时间内可将细胞及细胞外基质等溶液成分快速加热至>300℃, 使细胞活度低、细胞功能丧失及胶原蛋白液体阻塞。近年来研发了包活激光打印、电流体力学、超 声打印、基于阀的打印以及快速成型打印等，在避 免过热、保持细胞活力和表型、对液滴的控制、改 善喷嘴的堵塞等方面得到了改善。

4 展望

      理想的盆底重建手术是通过一些检测手段如基于磁共振的三维重建几何模型等来精确重建 PFD患者盆底解剖，发现患者的盆底支持结构的缺损部位及程度，据此制定盆底脱垂的修复手术方案，针对患者特异部位的缺损，取患者自体细胞 （如脂肪），体外培养诱导分化后，应用3D打印方法构建组织工程材料，如韧带、筋膜、肌肉等，根据患者的个体情况制成特定的形状，然后手术植入, 从而实现自体组织修复并最大限度达到解剖复位。应用3D打印技术构建组织工程补片有望快速建立兼具良好力学性能和生物相容性的组织工程补片，减少补片相关并发症的发生，同时实现以自动化的方式，扩大补片的制造规模及缩短制造周期，有可能成为女性盆底重建的发展新方向，为 实现盆底功能障碍性疾病的个体化治疗奠定基础。