日前，中华医学会病理学分会第二十次学术会议暨第四届中国病理年会在重庆召开。与会期间，北京大学人民医院赵昀教授、中国医学科学院肿瘤医院郭会芹教授、广东省人民医院梅平教授等专家对最新的 CINtec PLUS（p16/Ki-67 细胞学双染检测）以及 p16 组织学检测在宫颈癌筛查中的应用进行了交流探讨，以有效指导临床实践。
p16/Ki-67 同时表达提示细胞周期调控失调
持续性的人乳头瘤病毒（HPV）感染是导致宫颈癌的主要原因。通常，若 HPV 感染不清除，则会变成永久性，将产生病毒致癌蛋白 E6 和 E7，可分别与肿瘤抑制蛋白 p53 和视网膜母细胞瘤蛋白 pRb 结合，使这两种抑癌基因失活。
p53 是重要的肿瘤抑制蛋白，可参与细胞第一个间期（G1）的抑制，促进细胞凋亡和 DNA 修复。HPV E6 蛋白与野生型 p53 具有高度的亲和性，二者结合可使 p53 快速降解，由此可阻碍细胞对 DNA 损伤的反应，导致遗传性状改变的累积，进而产生基因型恶变。
HPV E7 蛋白可干扰细胞周期，使细胞持续分化和发生癌前病变，导致细胞调控失控，发生永生化，若未经治疗，则进展为癌症。E7 蛋白可优先与 pRb 结合，削弱 pRb 功能，扰乱转录因子 E2F 结合的能力，开始致癌转化过程，导致上皮细胞的生长失调控，引起包括 Ki-67、p16 蛋白在内的原本正常的细胞增殖蛋白出现异常表达。
p16 基因是细胞周期素依赖性激酶（CDK）抑制剂的典型代表，与多种肿瘤有关，称为多肿瘤抑制基因，其基因产物对 CDK4 的活性有抑制作用，也称为 p16INK4。 p16 过度表达提示正常细胞处于细胞周期的阻滞期，短时间的 HPV 感染不会影响细胞周期的调控，而持续性 HPV 感染的细胞的异常增生，导致 p16 过表达，因此 p16 过表达可作为宫颈病变的标志物。
而 Ki-67 是一种标志着细胞周期进展及增殖期细胞的核抗原基因，其表达仅限于细胞增殖周期的 G1、S、G2 期和 M 期，且在 G0 期表达缺失。Ki-67 过度表达提示细胞处于细胞周期的增殖期。通常生理机能正常的细胞，p16 和 Ki-67 的表达会相互拮抗，不会同时出现。如果，p16 和 Ki-67 同时过度表达，则提示 pRb 蛋白失活，细胞周期调控失调。
因此，在同一细胞中同时检测 p16 和 Ki-67 可作为细胞周期失调的标志物，其与高危型 HPV 病毒诱导的致癌性转化相关，能够帮助检出真正的病变细胞，且不依赖于形态学检查结果。当 p16/Ki-67 检测阳性时，可强烈提示高级别病变，为区分潜在高级别病变妇女提供了客观的检测指标。
2012 年 7 月，美国病理学家协会（CAP）和美国阴道镜和宫颈病理学会（ASCCP）指南指出，p16 可作为反映 HPV E6/E7 影响细胞增殖的标志物，有足够证据表明能够用于低级别肛门 - 生殖道鳞状上皮病变相关推荐，建议使用特定克隆号（E6H4）的 p16INK4a 抗体作为检测 HPV 感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物。该克隆号是全球唯一获得 IVD 认证的 p16INK4a 抗体。
CINtec PLUS（p16/Ki-67 细胞学双染检测）改善宫颈癌筛查分流管理
目前，我国宫颈癌筛查面临着细胞学检测敏感度较低（50-70%）、观察者间重复性差、质量控制不足、技术人员缺乏等问题，生物标志物 p16/Ki-67 的应用可以有效改善细胞学分流检测。
高灵敏度和特异性的 CINtec PLUS 检测可应用于：对无明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）的分流（特别是针对年轻女性）；低度鳞状上皮内病变（LSIL）分流；细胞学与 HPV 联合筛查时，对细胞学阴性但高危型 HPV 阳性者进行分流；以及 HPV 作为初筛时，对高危型 HPV 阳性者进行分流检测。
CINtec PLUS 技术可有效降低高级别宫颈病变的漏诊率，为临床和患者诊疗提供充分的时间与依据，改善前期宫颈疾病检测和早期干预。同时，也可以减少和避免不必要的阴道镜检查。
广东省人民医院梅平教授在会上分享了 CINtec PLUS 的临床研究数据。一项多国家、多中心的前瞻性研究 PALMS（Primary ASCUS LSIL Marker Study）对超过 27,000 名、平均年龄 39.9 岁的妇女进行筛查。试验期间对所有妇女进行传统的细胞学（巴氏涂片）、p16/Ki-67 双染（CINtec PLUS）及 HC2 HPV 检测，并以活检确认 CIN2+ 为检测终点。
研究证实， 相比传统细胞学，CINtec PLUS 检测在不影响特异性的前提下，对 CIN2+ 的敏感性提高 18%（86.7% vs 68.5%）。对于 HPV 阳性妇女的分流，相比传统细胞学，CINtec PLUS 双染检测对 CIN3 的敏感性提高 17%（88% vs71%）。
在 575 例细胞学检测为 ASC-US 的患者中，18 例患者经活检证实为 CIN2 以上， CINtec PLUS 双染的灵敏度为 94%，特异性为 78%，且高于 HC2 HPV 检测。同时，526 例 LSIL 患者中，有 63 例经活检证实为 CIN2 以上，此时 CINtec PLUS 检测特异性为 54%，远高于 HC2 HPV 检测。
此外，EEMAPS（European Equivocal or Mildly Abnormal Papanicolaou Cytology）回顾性研究对 5 个欧洲细胞学实验室总计 776 例 ASC-US/LSIL 液基细胞学（ThinPrep）剩余标本，进行了细胞学采样后 6 个月内活检、p16/Ki-67 双染（CINtec Plus）及 HC2 HPV 检测。
其中，在 361 例 ASC-US 患者中，有 77 例证实为 CIN2 以上；在 425 例 LSIL 患者中，有 72 例证实为 CIN3 以上，CINtec PLUS 检测针对 CIN3+ 以上检测的灵敏度达到 96%，而特异性为 68%，高出 HC2 HPV 检测 49%，说明双染检测可作为更合理的 LSIL 分流手段。
当采用细胞学与 HPV 联合筛查时，CINtec PLUS 双染检测可应用于对细胞学阴性但高危型 HPV 阳性者进行分流检测。一项入组 425 例 30 岁以上、细胞学阴性、高危 HPV 检测阳性妇女的试验结果显示，CINtec PLUS 双染检测针对 CIN2+ 的灵敏度达到 91.9%，而特异性为 82.1%，针对 CIN3+ 的灵敏度达到 96.4%，而特异性为 76.9%。
会上医科院肿瘤医院的郭会芹教授还分享了 CINtec PLUS 的阅片体验，双染阅片可以有效的减轻阅片医生的负担。另外，对于形态学诊断有疑难的病例，如一些拥挤的细胞团到底是 HSIL 还是反应性改变，双染检测可以起到辅助诊断的作用。
罗氏诊断 CINtec PLUS Cytology 检测可实现对 p16 与 Ki-67 的联合检测，具有优秀的特异性和灵敏度，p16 信号（棕色）与 Ki-67 信号（红色）在同一个细胞内，以同时出现胞浆的棕染和胞核的红染可判断为阳性结果。该检测预计将于 2015 年年底在中国上市。
p16 组织学检测：提高病理诊断的准确性，指导宫颈癌临床诊疗
北大人民医院的赵昀教授，从临床医生的角度，探讨了 p16 在临床中的使用意义。赵教授在会上特别强调了宫颈病变的过度治疗，给患者带来的损伤，因此临床需要准确的病理诊断结果以指导患者的治疗。
通常，宫颈鳞状上皮癌前病变即宫颈上皮内瘤样病变（CIN）按病变程度分为 CIN1、CIN2 和 CIN3，临床根据不同的病变程度治疗策略也不尽同。对 CIN 进行更准确的分级，对于临床治疗决策至关重要。
虽然 H&E（Hematoxylin-eosin staining，苏木精 - 伊红染色法）染色组织形态学的判读是目前对 CIN 进行分级的标准，但它容易受到病理医生主观判断的影响，尤其是 CIN2 的可重复性最差。
随着基础和临床研究的不断深入，HPV 和宫颈癌之间的关系日益明确，逐渐认识到，HPV 以游离状态存在于宫颈细胞中，通常引起宫颈低级别病变（LSIL），其进一步进展为宫颈癌的风险极低，不是真正的癌前病变；以整合形式存在于宿主细胞时，则引起宫颈高级别病变（HSIL），这才是真正的癌前病变，进展为宫颈癌的风险高。
基于此，美国病理学会（CAP）和美国阴道镜和病理协会（ASCCP）联合发表共识 (LAST 项目)，建议将宫颈鳞状上皮内病变采用两级命名法，分为低级别和高级别病变。前者包括三级命名法的 CIN1，后者包括 CIN2、CIN3。2014 年出版的第四版女性生殖器官肿瘤 WHO 分类也推荐采用该命名法。
但在实际工作中，CIN2 的 H&E 诊断结果一致性较低，即便是在病理医生严格受训的美国，医生对同一病例的诊断也存在较大分歧。实际上，CIN2 中部分是真正的高级别病变，还有相当一部分是低级别病变。当形态学鉴别高级别或低级别病变存在争议时，推荐采用生物标志物辅助鉴别诊断。
LAST 项目证实，p16INK4a 的应用对提高诊断一致性具有高质量证据，推荐在以下四种情况使用 p16INK4a 染色：HSIL 和类似非肿瘤性病变需要鉴别诊断时，如不成熟鳞化、萎缩、修复性上皮增生及人工操作所致假象；有疑问的 CIN2；不同阅片人诊断意见不同；HPV 检测、细胞学、阴道镜提示有高级别病变可能，但组织学诊断为阴性。
基于 LAST 项目数据，2014 年 WHO 也推荐对于有疑问的诊断，可以采用 p16INK4a 免疫组化染色，提高宫颈病变组织学诊断的准确性和病理医师之间诊断的一致性。
基于病理学诊断的更新，宫颈病变临床管理随之调整。CAP 和 ASCCP 推荐 LSIL 管理同 CIN1 的管理；HSIL，对于大多数女性而言，管理同 CIN2/3。对于 CIN2/p16INK4a 阴性的病例按照低级别病变（LSIL）管理，随诊观察；对于 CIN2/p16INK4a 阳性的病例按高级别病变（HSIL）管理，推荐治疗。
根据 SEER 研究统计，25 岁以下女性宫颈癌发病率仅为 1.5/100,000。因此，对于年轻女性的 HSIL（CIN2）或 HSIL 但未明确 CIN2 或 3 的病例，可以每 6 个月进行一次细胞学和阴道镜检查，若病变持续 24 个月、阴道镜检查不满意、病变面积增大或阴道镜检查较之前加重，则给予治疗。
通过生物标志物 p16INK4a 能够从更微观的层面理解宫颈癌前病变的病理机制，提高 LSIL/HSIL 判读的准确性，确保临床对患者进行更合理的分流管理。罗氏诊断 CINtec 组织学 p16 检测（包含抗 p16INK4a 抗体（E6H4））已于 2014 年 5 月在中国上市。